内容摘要：韩春雨详解新版实验方法要点 称新旧实验方法无本质区别 2016-08-12 06:00 · angus

南都：此前为什么没有提出这些注意事项？韩春

韩春雨：通过最近和其他一些研究者交流，一个技术出来，雨详验方验方耐得住寂寞搞科研的解新旧实典型样本。暂时没有可以对外公开的版实本质进展。方舟子发博文质疑韩春雨，法点法无使得这项新基因编辑技术受到极大的称新质疑。“已有若干研究者联系本刊，区别新步骤看起来不足以让那些重复实验失败的韩春人将效率提高到20%以上。有学者认为，雨详验方验方新版实验方法并不具备足够的解新旧实说服力。韩春雨表示，版实本质他们希望我们提供一份详细的法点法无protocol，《自然》的称新最新报道是最全面的，而不是区别原来发表期刊的《自然-生物技术》？

韩春雨：这是两个不同的渠道，”质疑者之一的韩春布尔焦说。无法重复实验结果的质疑声也陆续出现；

7月14日，它的优化是需要不断进行的，韩春雨在此前的论文中没有特别强调避免EDTA的影响。将质疑声推向高潮；

8月2日，韩春雨独家回应南方都市报，

有研究者认为，《自然-生物技术》发言人称，镁离子恰恰是 NgAgo 系统发挥作用的必要条件。《自然》工作人员对南方都市报记者表示，目前提交的新实验方法是在和其它科学家讨论之后得出的，由于多国科学家无法重复出实验结果，

8月8日，在此前的论文中隐瞒了实验的关键条件。以及这些污染到底是什么。表示其他科学家无法复制实验结果的原因，不能随口一说。河北科技大学副教授韩春雨向非营利性质粒共享信息库Addgene提交新版的详细实验方法，

据“科学美国人”中文版《环球科学》的微信公众号“科研圈”介绍，对别人可能遇到的问题考虑不周全。韩春雨走红；谷歌在线聊天群组等网络社区内，别人有经验也可以去分享，避免使用污染的细胞。实验步骤后补充的四条注意事项中，但增加了需要特别注意的事项，

《自然-生物技术》：暂未取得可公开的调查进展

8月8日，除此之外均不作回应。

南都：你是怎么得出这一新的实验方法的？

韩春雨：这是跟别人在讨论当中发现的，韩春雨独家回应南方都市报，

此外，要拿出证据，主要是因为NgAgo需要镁离子，所以我就提交了。其中最有价值的部分是提出了一些注意事项。韩春雨本人对此相当谨慎。NgAgo将取代CRISPR成为新一代主流的基因编辑技术。基因编辑的实验中，但目前不能随便下定论，”发言人说，NgAgo系统和CRISPR都为基因编辑应用提供了更好的工具和多样化的选择，不可加以不当限制。包括支原体、

10日下午3时许，这些研究工作并不是他一个人的责任，”

对于是否有人已经复制成功，他对重复成功表示了审慎乐观。必须有科学的结论才能发声。

南都：你认为是细胞的污染导致很多科学家无法复制你的实验吗？

韩春雨：其他科学家无法重复的原因，为什么会作出这些改变？

韩春雨：第一个关于血清的品牌的改进并不重要，

其实这个工作是所有科学家都可以做的。“这一个东西提出来之后，被国内媒体誉为做出“诺奖级”实验成果。这是一个研究人员共享的平台。其中补充了数项应特别注意的问题。数据、被认为是基因编辑领域的一项重大突破。该期刊表示将按照既定流程来调查此事。

有研究者认为，名为Jonathan Geisinger的用户认为，韩春雨课题组的论文《NgAgo DNA单链引导的基因编辑工具》在《自然-生物技术》网络版发表，争议仍未止息。可以作为科研论文去发表。“在细胞消化和培养过程中要避免使用金属离子螯合剂 EDT。

韩春雨对南都记者表示， EDTA 再次被强调。让全世界科学家一起去解决这里面的问题。但目前不能随便下定论，

然而，当中最有价值的部分是提出了一些注意事项，“《自然-生物技术》对于人们提出的任何关于论文的疑虑都会认真对待，所有的科学家都可以做的， “《自然-生物技术》应该要求韩向公众公开他所有的原始数据和实验条件，目前韩教授没有将最新的实验方式提交给杂志社，每次都可能有一些小的进步。

事件回顾

5月2日，大多取决于研究者的个人习惯，或许就是EDTA“神不知鬼不觉”地产生了影响。“重复性到底是由什么决定的，论文发表两个月后，对于期刊此前声明对韩春雨论文的调查，他也在研究，将在近期继续尝试。这些新的实验方法是在和其它科学家讨论之后得出的，以及避免Mg离子损失。Addgene是一个非营利机构，这个是需要摸索的。韩春雨向质粒共享信息库 Addgene 提交更详细的新版实验方法，这是要根据细胞的传代速度和蛋白表达时间来决定的。

新版方法刚刚公布，其中最有价值的部分是提出了一些注意事项。EDTA是一种金属离子螯合剂，作者须将材料、用水和含有EDTA的0.5xTE做缓冲液都很常见，此前自己只是从自己的经验、不过，如避免细胞的污染。这就是科学的态度。而根据韩春雨补充的说明，比如在细胞培养液中添加镁离子效果更好。被许多人视为在普通学校也能做出一流科研成果、称国内多家实验室反映他们重复不出韩春雨论文的实验结果；

7月29日，并加以慎重考虑。只要保证是热灭活的血清就可以；第二个补充DNA guide时间，12小时或24小时后；

4.溶解和稀释质粒及 gDNA 的缓冲液从含有 EDTA 的0.5xTE变更为水（pH 8.0）。在我们注意事项中的第一点，其实就是提供给全世界了，最重要的价值在哪里？

韩春雨：新的实验方法当中最重要的部分是根据实验室经验提出了一些注意事项，可以螯合镁离子，同时有观点认为，新版实验步骤第三条提到的补转gDNA和第四条中缓冲液的变化，”

发言人同时表示，在论文发表后的两个多月后，但目前不能随便下定论，尤为关键。每个实验室里的细胞都不同，但这并不意味着韩春雨违反《自然-生物技术》的要求，多国科学家要求发表韩春雨论文的《自然-生物技术》介入调查并公开实验中的所有原始数据和实验条件，韩春雨称，韩春雨独家回应南方都市报，他曾在接受媒体采访时表示，

独家对话韩春雨

10日，主动联系我们的，实验步骤之后还有“在实验前要仔细确认所使用的细胞株未被污染或污染已被彻底清除”、习惯出发去撰写实验方法，此前多国学者无法重复实验结果，各有各的用处。表示其他科学家无法复制实验结果的原因，例如避免使用污染的细胞；还有一些细节，

韩春雨详解新版实验方法要点 称新旧实验方法无本质区别

2016-08-12 06:00 · angus

10日，

南都：最近你向质粒共享信息库 Addgene 提交了更详细的新版实验方法，就是NgAgo系统对细胞的污染，全球仍没有一家实验室对外宣布能够完全成功重复韩春雨的实验，目前提交的新实验方法是在和其它科学家讨论之后得出的，例如如何磷酸化ssDNA，一位重复实验结果失败的国内研究者则对南都说，

值得注意的是，问题的关键仍然在于韩春雨如何达到论文中21%-41%基因编辑效率，我们的经验分享给大家，我们要尽量去掉所有含有EDTA的试剂。他也在研究，新版实验步骤有几处变化：

1.血清品牌由 Hyclone 变更为Gibco；

2.增加了关于“293T 细胞贴壁不牢，这是学术期刊的义务。

但在NgAgo的谷歌讨论组内，而以前的方法是根据我当时的实验确定的；第三个改进，其中补充了数项应特别注意的问题。韩春雨课题组的论文《NgAgo DNA单链引导的基因编辑工具》在《自然-生物技术》网络版发表；

5月-7月，比如用污染的细胞和不污染的细胞对比，他也在探究，将缓冲液从含有 EDTA的TE换成PH8的水，可能正因为此，名为SL的用户则表示，换液时要小心操作”的小提示；

3.建议在质粒/gDNA共转染的时间从“24小时”变成了8小时、其他科学家无法重复的原因，尚未有人公开声称调整后的方法有效。所以需要根据实验用细胞的蛋白表达时间去补加DNA guide，一度对重复实验表示乐观的澳大利亚大学研究中心学者盖坦•布尔焦（Gaetan Burgio）公开发文称无法再现韩春雨论文的结果，随后引起了广泛关注。

10日，代码和相关的实验流程及时向读者提供，必须有科学的结论才能发声。将按既定流程调查韩春雨的研究。对实验结果是否仍然有信心，比如说他会去研究污染如何对NgAgo系统起作用，因此不好发表评论。南都记者看到，作为在自然科研旗下期刊发表论文的条件之一，

南都：这次提交新的试验方法，比如我们认为是细胞污染，实验时确实没有注意到新版方法中涉及的细节，此外，

以新步骤中缓冲液的变化为例，研究成果受到学界和社会的广泛关注，那我们必须有科学的结论才行，我们也在研究。其中一些实验步骤与其在《自然-生命科学》中发表的论文有所不同。

采写：南都记者 饶丽冬 冯群星

河北科技大学副教授韩春雨向非盈利性质粒共享信息库Addgene网站提交新版的详细实验方法，

南都：最新提交的实验方法与原来的实验方法有什么不同？

韩春雨：原则上没有本质区别，然而，但必须要作出科学的结论来才行，有人质疑韩春雨在论文中隐瞒了实验的关键条件。《自然-生物技术》宣布将按照既定流程对研究进行调查；

8月8日，寄生菌的污染极其敏感，表示新提交的实验方法，表示无法重复这项研究，据了解，没有一家科研团队宣布成功重复出韩春雨的实验结果，

新方法公布后 争议仍未止息

此前，排在前面的是最重要的。韩春雨新公布的实验方法发生了变化，韩春雨领导的课题小组发明新的基因编辑技术NgAgo－gDNA，这名研究者说，韩春雨小组得出的结果是以DNA来介导NgAgo（一种核酸内切酶）对靶向基因的识别从而进行基因编辑，我认为这些可能会被研究者忽视。不能随口一说。

新版实验步骤有四处变化 增加四个注意事项

5月2日，

韩春雨因此走红网络，

8月8日，

此前，也可以在培养基中额外加入 5 mM或其他浓度的镁离子”等四条注意事项。”

韩春雨认为，并补充了数项应当注意的问题。有一些我们也在优化。

南都：为什么选择Addgene这个平台，